Los primeros habitantes de la región en la época prehispánica fueron los Xincas, quienes ocuparon todo el territorio desde la costa del actual departamento hasta las montañas de Jalapa.
El señorío Xinca de Santa Rosa, fue el más aguerrido y valiente durante la conquista española en el siglo XVI. El conquistador Pedro de Alvarado los tomó como esclavos para la reducción militar de Cuzcatlán en la actual República de El Salvador. De este hecho se deriva el nombre del pueblo, el río y el puente Los Esclavos, en el municipio de Cuilapa. Hay testimonios de que estos indígenas fueron los primeros esclavos formalmente asignados por los conquistadores en el paraje que actualmente lleva ese nombre.
Con la llegada de los europeos, los indígenas Xincas de otras etnias originarias fueron extinguidos, y los habitantes españoles y criollas, se asentaron en esas tierras fértiles. Por esta razón histórica, en la actualidad la población del departamento es de clara ascendencia mestiza y "ladina vieja", con conexiones muy directas con los primeros hacendados y ganaderos hispanos. Sin embargo, actualmente en algunos municipios como Chiquimulilla y San Juan Tecuaco, existe una tendencia a la inmigración de habitantes de la República de El Salvador.
La vida del departamento se inicia alrededor del pueblo que se llamó Nuestra Señora de los Dolores o de la Candelaria de los Esclavos, el cual en 1570, contaba con un sacerdote.
El 21 de agosto de 1573, a solicitud de Baltazar de Orena, síndico procurador, las autoridades del reino acordaron la construcción del puente de Los Esclavos, que se inició en 1592.
Durante el período hispánico, la mayor parte del territorio que hoy integra Santa Rosa, correspondió a la alcaldía de Escuintla y Guazacapán, este último conocido también como partido.
El comercio y la fertilidad de sus tierras llevaron la prosperidad económica a la región que es un importante punto de tránsito comercial, por ser paso obligado de las mercancías que procedían de Honduras y El Salvador.
Para 1825 la Asamblea Nacional Constituyente dividió el estado de Guatemala, en siete departamentos, siendo el tercero el de Guatemala-Escuintla, integrado por los pueblos de Guatemala, Escuintla y Guazacapán, subdividiéndolo en siete distritos, entre los que figuraba Cuajiniquilapa (Cuilapa), que pasó a ser la cabecera departamental.
Para mejorar la administración, en 1848, el gobierno dividió al departamento de Mita en tres distritos: Jutiapa, Santa Rosa y Jalapa. Más adelante, por Decreto del 8 de mayo de 1852, se decidió a crear el departamento de Santa Rosa como se encuentra actualmente.